mercoledì, 20 febbraio 2019

Le proteine rappresentano le unità funzionali primarie dei processi cellulari: mutazioni genetiche infatti possono portare a una progressione del tumore dovuta all’alterazione dei livelli e/o dell’attività delle proteine mutanti. Alterazioni nell’espressione proteica, modifiche post-traslazionali, struttura e interazioni sono state infatti associate con tutte le patologie.

Mentre il genoma di un organismo può essere considerato fisso, il proteoma di una cellula è dinamico e può variare non solo tra diversi tipi di cellule ma anche tra cellule che presentano la stessa morfologia. Ciò è dovuto al fatto che il proteoma dipende dalla segnalazione extracellulare e dunque mostra una variazione regionale e temporale.

È ben noto che mRNA e proteine mostrano frequentemente diversi livelli di espressione dovuti a diversi tassi di degradazione, modifiche post-traslazionali e compartimentalizzazione sub-cellulare. Infatti l’intervallo di abbondanze in cui le proteine si possono trovare è molto ampio, ad esempio il proteoma del plasma si estende su oltre 10 logs di abbondanza molare. Inoltre le varianti dovute allo splicing, a processi proteolitici e a modifiche post-traslazionali rendono il numero delle diverse forme proteiche (proteoforme) molto più alto del numero di geni: mentre il genoma umano contiene approssimativamente 21.000 geni che codificano per proteine, il numero di forme proteiche è stato stimato essere 10 volte più grande.

L’ampio intervallo dinamico lineare e l’elevata complessità del proteoma rendono la sua caratterizzazione un’ardua sfida analitica, che è resa ancora più difficile della mancanza di tecniche di amplificazione proteica analoghe alla PCR. La spettrometria di massa si è consolidata come la metodica di scelta per la proteomica e in seguito a una decade di rapido sviluppo tecnologico e metodologico, che ha permesso l’identificazione di specifici prodotti proteici a partire da tutti i geni codificanti per proteine, si è aperta l’era della proteomica basata sulla spettrometria di massa.

Il laboratorio di proteomica è focalizzato sullo sviluppo e applicazione di metodi in spettrometria di massa per studiare le variazioni biomolecolari che si riscontrano nello sviluppo e progressione del tumore. L’elevata eterogeneità morfologica nei tumori come quello alla mammella riflette l’elevata complessità cellulare della patologia: lo sviluppo del tumore infatti coinvolge molti tipi di cellule ed è influenzato dal microambiente tumorale stesso. Dunque lo studio delle interazioni molecolari richiede un’elevata specificità cellulare e spaziale. Nel laboratorio di proteomica vengono sviluppate e applicate due diverse metodologie:

Proteomica ultrasensibile
L’analisi istopatologica viene usata per identificare gruppi di cellule specifici di un particolare tipo cellulare e regione. Le esatte coordinate di queste regioni sono poi trasferite a un sistema di microdissezione laser (LCM) per il loro isolamento, oppure a una sonda per l’estrazione localizzata da tessuti basata sul campionamento dalla superficie del tessuto mediante giunzione liquida. Queste tecnologie di microcampionamento posso essere combinate con quasi tutti i sistemi di purificazione e separazione di biomolecole, che sono a loro volta accoppiati ai più recenti spettrometri di massa, permettendo analisi quantitative e approfondite del proteoma.
Le aree di interesse sono:

  1. Proteomica ultrasensibile per l’analisi di campioni di tessuto microdissecati.
  2. Applicazione clinica della combinazione tra microdissezione/microcampionamento e LC-MS/MS.
  3. Caratterizzazione dei proteoforme e determinazione del loro ruolo nella patologia.

Imaging in spettrometria di massa
Le tecniche moderne di spettrometria di massa possono generare, direttamente dal tessuto, profili biomolecolari costituiti da centinaia di ioni molecolari. L’imaging con spettrometria di massa può registrare simultaneamente la distribuzione spaziale di tutti questi ioni. Dopo l’esperimento in massa viene effettuata una colorazione istologica del tessuto e viene acquisita un’immagine digitale ad alta risoluzione che è poi allineata col dataset ottenuto dall’ MSI. La microdissezione virtuale del dataset MSI, basata sull’esame istopatologico, permette di ottenere spettri di massa specifici per determinati tipi di cellule e regioni del tessuto. Usando la stessa tecnologia, ma diversi metodi per la preparazione del campione, la MSI viene utilizzata per ottenere mappe spazio-chimiche di proteine, glicani, lipidi, metaboliti e neurotrasmettitori su tessuto.
Le aree di interesse sono:

  1. Analisi con elevata risoluzione di massa per la caratterizzazione spazio-chimica di proteoforme su tessuto.
  2. Imaging multimodale – integrazione del MSI con altre metodologie di imaging per una più specifica caratterizzazione cellulare.
  3. Analisi con elevata risoluzione spaziale e di massa di metaboliti e neurotrasmettitori.

Il laboratorio di proteomica è equipaggiato con le più recenti tecnologie basate su spettrometria di massa, che includono un Orbitrap Fusion (Thermo Scientific) e un Orbitrap Q-Exactive Plus (Thermo Scientific), un robot AssayMAP BRAVO (Agilent) per la manipolazione automatizzata di campioni e un laboratorio di patologia pienamente operativo.

Il Proteolab è diretto da Liam McDonnell.